研究課題名：2光子励起顕微鏡法を用いたシナプス・開口放出機構の研究

1．研究課題名：

2光子励起顕微鏡法を用いたシナプス・開口放出機構の研究

2．研究期間：

平成16年度～平成20年度

3．研究代表者：

河西　春郎（東京大学大学院医学系研究科・教授）

4．研究代表者からの報告

（1）研究課題の目的及び意義

　2光子励起断層顕微鏡法は近赤外のフェムト秒レーザーを光源として用い、他の顕微鏡法では観察できないインタクトな組織内部の分子細胞機構の観察を可能としている。更に、我々は2光子励起をケイジドグルタミン酸に適用し、大脳皮質錐体細胞の樹状突起の単一スパイン（シナプス後部構造）を刺激する方法を確立し、スパインの形態と機能に強い相関があることを解明した。また、この2光子励起グルタミン酸法によって、単一スパインレベルで可塑性を誘発することに成功し、シナプス可塑性の基盤に早期から形態変化が伴うこと、及び、長期可塑性はスパインの初期形態に依存することを見出した。このシナプスの形態・安定性・機能の連関は大脳の記憶の分子細胞的実態と考えられる。この仮説を具体的に検証するために、シナプスの形態・安定性・機能連関の定量的解明を進め、シナプスレベルの脳機能解析法を開拓する。一方、開口放出はシナプス前終末のみならず内分泌細胞、血液細胞の主要な機能でありシナプス後部でも重要な役割を果たすと考えられている。我々は、2光子励起法の同時多重染色性を生かした開口放出の新しい網羅的解析法を分泌細胞において確立した。本研究ではこれを発展させ、代表的な分泌細胞の開口放出機構の解明を更に進め、これに基づきシナプスでの開口放出の直接的測定法を開発し、シナプス機能の統合的理解を進める。

（2）研究の進展状況及び成果の概要

　2光子励起法による光化学と2光子蛍光観察を同時に行う二重走査2光子励起顕微鏡を新たに構築し、これを応用してスパイン及び開口放出の研究を進めている。スパインの解析は、主に海馬で系統的に進め、開口放出については、主に分泌細胞での解析を進めた。その結果、次の様な進捗及び成果を得ている。
1）スパイクタイミング依存的可塑性の形態基盤を明らかにしつつある。
2）これと関連して長期抑圧の形態基盤の解明も進み、長期増強とは異なる空間的広がりを持つことがわかってきた。これはシナプスの局所的な競合過程を初めて単一シナプスレベルで可視化するものである。
3）単一スパインのNMDA受容体を介するカルシウム動態を定量化することに成功し、小さなスパインの可塑性の形態基盤として、スパインネックが細く独立した大きなカルシウム上昇を起こしやすいことが重要であることを報告した。
4）単一スパイン内のFアクチン動態を可視化することに初めて成功し、回転率の異なる二つのFアクチンのプールがあることを見出した。大きなスパインには遅い回転のプールが多く、これがスパインを安定化させている可能性が示唆された。
5）開口放出に伴う、関連分子の動態を可視化する研究を報告した。
6）開口放出に伴う、融合関連分子（SNAP25）の構造変化をFRETで捉えることに成功しつつある。

5．審査部会における所見

A（現行のまま推進すればよい）
　2光子励起法による光化学と2光子蛍光観察を同時に行う二重走査2光子励起法顕微鏡を新たに構築し、これを応用して樹状突起のスパインおよび開口放出の研究を順調に進めている。スパイン形成に関しては、スパイクタイミング依存的可塑性の形態基盤を明らかにしつつある。長期抑圧の形態基盤の解明も進み、長期増強とは異なり、空間的な広がりを持つことを見いだしている。また、スパイン内のアクチン線維動態の可視化にも成功し、2つの動的プールがあることを証明している。これらは、世界的に見ても画期的な成果といえる。開口放出の解析についても、SNAP25の構造変化をFRETで捕らえるなど順調に進展しており、研究組織も効率よく考えられている。また、周囲の研究室や研究機関とも有機的な連携が行われている。購入された設備は研究目的に合わせて有効に活用されている。