「特別推進研究」研究期間終了後の効果・効用、波及効果に関する自己評価書

（1）種々の非天然アミノ酸の作製と薬剤探索への応用

　さらに実用的な蛍光基をもつ非天然アミノ酸が作製され、蛋白質の挙動を蛍光法で追跡する手法として確立された。蛍光性アミノ酸導入キットも市販され、誰でも使える手法となった。さらに20種類程度の異なる蛍光性アミノ酸が合成され、それらを用いた高効率ペプチド薬剤スクリーニング手法が発展しつつある。

（2）非天然アミノ酸導入法の高効率化

　蛋白質生合成に関与するtRNA（運搬リボ核酸）やEF-Tu（蛋白質伸張因子）が非天然アミノ酸導入に最適化され、それらを用いて今まで導入できなかった種類の非天然アミノ酸も蛋白質に導入できるようになった。また3種類の異なる非天然アミノ酸を1本の蛋白質に導入することにも成功した。

（3）酵素を使わないtRNA（運搬リボ核酸）のアミノアシル化と生きた細胞中での非天然変異蛋白質の発現

　非天然アミノ酸の蛋白質導入の第1段階である、アミノ酸のtRNA（運搬リボ核酸）への担持（tRNA（運搬リボ核酸）のアミノアシル化）は、従来酵素を用いないとできなかった。この段階を人工物であるペプチド核酸をつかって特定のtRNA（運搬リボ核酸）を認識し、それに非天然アミノ酸を結合させる手法が見出された。この方法を用いて、生きた細胞中での非天然アミノ酸導入蛋白質の作製が検討されている。

（4）リボソームを用いない非天然アミノ酸の蛋白質導入と医療応用

　非天然アミノ酸をリボソームを用いないで蛋白質やペプチドのN末端に迅速簡便に導入する手法が見出された。この方法を用いた医療診断のためのプローブ分子作製への展開が行われている。

論文発表（原著論文および総説類）

• （1）K. Ninomiya, T. Kurita, T. Hohsaka, and M. Sisido, Facile aminoacylation of pdCpA dinucleotide with a nonnatural amino acid in cationic micelle, Chem. Commun. 2003(17), 2242-2243 (2003).
• （2）宍戸昌彦，“生化学システムの拡張と非天然アミノ酸のタンパク質への導入”，生物工学会誌，81(9), 386-391 (2003).
• （3）二宮啓子，宍戸昌彦，“酵素を使わないtRNA（運搬リボ核酸）のアミノアシル化――非天然アミノ酸の蛋白質導入への第1ステップ――”，酵素工学ニュース，50, 12-19 (2003).
• （4）宍戸昌彦、“分子ナノテクノロジーとバイオテクノロジーの融合”、月刊未来材料、3月、(2003)
• （5）H. Sasaki, K. Ikeda, M. Suzuki, K. Ninomiya, M. Sisido, Incorporation of Anthraquinonyl Group into λ-Cro Repressor Protein for Strand- and Position-Specific Photocleavage of Double-Stranded DNA, Biopolymers, Peptide Science, 76(1), 21-26 (2004).
• （6）T. Hohsaka, N. Muranaka, C. Komiyama, K. Matsui, S. Takaura, R. Abe, H. Murakami, and M. Sisido, Position-Specific Incorporation of Dansylated Nonnatural Amino Acids into Streptavidin by using a four-base codon, FEBS Lett., 560, 173-177 (2004)
• （7）M. Kitamatsu, M. Shigeyasu, T. Okada, and M. Sisido, Oxy-peptide nucleic acid with a pyrrolidine ring that is configurationally optimized for hybridization with DNA, Chem. Comm. 2004(10), 1208-1209 (2004).
• （8）K. Yamanaka, H. Nakata, T. Hohsaka, and M. Sisido, Efficient Synthesis of Nonnatural Mutants in E.coli in vitro Protein synthesizing System, J. Biosci. Bioeng., 97(6), 395-399 (2004).
• （9）K. Ninomiya, T. Minohata, M. Nishimura and M. Sisido. In Situ Chemical Aminoacylation with Amino Acid Thioesters Linked to a Peptide Nucleic Acid, J. Am. Chem. Soc., 126, 15984-15989 (2004).
• （10）M. Sisido, Point-to-Point Electron Transfer and Energy Transfer on a Protein--- A new tool for the analysis of 3-dimensional structure of a protein---, in “Fusion of Nanotechnology and Organic Semiconductors”, Proceedings of the 4th Chitose International Forum on Photonics Science & Technology, O. Karthaus, C. Adachi, H. Sasabe, Eds.,PWC publishing, pp.75-78 (2004).
• （11）M. Sisido, Synthetic Expansion of the Central Dogma: Chemical Aminoacylation, 4-Base Codons and Nonnatural Mutagenesis in "Peptide Revolution: Genomics, Proteomics & Therapeutics", Proceedings of the Eighteenth American Peptide Symposium, M. Chorev and T. K. Sawyer, Eds. American Peptide Society, San Diego, USA, pp.294-300 (2004).
• （12）瀧真清、宍戸昌彦、“活性蛋白質の蛍光標識技術”、化学、59(9), 72-73 (2004).
• （13）H. Hamada, N. Kameshima, A. Szymańska, K. Wegner, L. Łankiewicz, H. Shinohara, M. Taki and M. Sisido, Position-Specific Incorporation of a Highly Photodurable and Blue-Laser Excitable Fluorescent Amino Acid into Proteins for Fluorescence Sensing, Bioorg. Med. Chem. 13(10), 3379-3384 (2005).
• （14）H. Taira, M. Fukushima, T. Hohsaka, and M. Sisido, Four-Base Codon-Mediated Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Proteins in a Eukaryotic Cell-Free Translation System, J. Biosci. Bioeng. 99(5), 473-476 (2005).
• （15）D. Kajihara, T. Hohsaka and M. Sisido, Synthesis and Improvement of Nonnatural Mutants of GFP Containing Aromatic Nonnatural Amino Acids at Tyr66 Position, Protein Eng. Design and Selection, 18(6), 273-278 (2005).
• （16）N. Hashimoto, K. Ninomiya, T. Endo and M. Sisido, Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation, Chem. Commun. 2005(34), 4321-4323 (2005).
• （17）M. Kitamatsu, M. Shigeyasu and M. Sisido, Fluorescence Detection of Hybrid between Pyrolidine-Based Oxy-Peptide Nucleic Acid and DNA, Chem. Lett. 34(9), 1216-1217 (2005).
• （18）T. Ohtsuki, T. Manabe and M. Sisido, Incorporation of multiple kinds of nonnatural amino acids into a protein by tRNAs with nonstandard structures, FEBS Lett., 579, 6769-6774 (2005).
• （19）M. Sisido, K. Ninomiya, T. Ohtsuki, and T. Hohsaka, Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with nonnatural amino acids, METHODS, 36(3):270-278 (2005).
• （20）宍戸昌彦、“非天然アミノ酸導入変異タンパク質の作製”、タンパク質科学、構造、物性、機能、後藤、桑島、谷澤編、第8章第2項、341-350　化学同人(2005).
• （21）H. Nakata, T. Ohtsuki, R. Abe, T. Hohsaka and M. Sisido, Binding efficiencies of EF-Tu to tRNAs charged with fluorescent nonnatural amino acids, Anal. Biochem., 348(2), 321-323 (2006).
• （22）M. Kitamatsu, M. Shigeyasu, M. Saitoh and M. Sisido, Configurational Preference of Pyrrolidine-Based Oxy-Peptide Nucleic Acids as Hybridization Counterparts with DNA and RNA, Biopolymers, Peptide Sci., 84, 267-273 (2006).
• （23）M. Taki, J. Matsushita and M. Sisido, Expanding the Genetic Codes in a Mammalian Cell with Introduction of 4-Base Codon/Anticodon Pairs, ChemBioChem, 7, 425-428 (2006)..
• （24）N. Muranaka, T. Hohsaka and M. Sisido, Four-base codon mediated mRNA display to construct peptide libraries that contain multiple nonnatural amino acids, Nucleic Acids Res., 34(1), e7 (1-9) (2006).
• （25）M. Kitamatsu, T. Kashiwagi, R. Matsuzaki and M. Sisido, Synthesis of a Novel Pyrrolidine-Based Peptide Nucleic Acid that Contains Tertiary Amines in the Main Chain and its Internalization into Cells, Chem. Lett., 35(3), 300-301 (2006).
• （26）H. Taira, T. Hohsaka, M. Sisido, In vitro selection of tRNAs for efficient four-base decoding to incorporate nonnatural amino acids into proteins in an E. coli cell-free translation system, Nucleic Acids Res., 34(5), 1653-1662 (2006).
• （27）K. Ninomiya, K. Tanimoto, N. Ishida, D. Horii, M. Sisido, and T. Itoh, Synthesis of novel gem-difluorinatedcyclopropane hybrids: Applications for DNA cleavage agents switched by photo irradiation, J. Fluorine Chem., 127, 651-656 (2006).
• （28）M. Arita, T. Suematsu, A. Osanai, T. Inaba, H. Kamiya, K. Kita, M. Sisido, and Yoh-ichi Watanabe, and T. Ohtsuki, An evolutionary "intermediate" state of mitochondrial translation system found in parasitic nematode, Trichinella spp.: Co-evolution of tRNA and EF-Tu, Nucleic Acids Res., 34, 5291-5299 (2006).
• （29）M. Taki, A. Kuno, S. Matoba, Y. Kobayashi, J. Futami, H. Murakami, H. Suga, K. Taira, T. Hasegawa, and M. Sisido, Leucyl/Phenylalanyl-tRNA-protein transferase-mediated chemoenzymatic coupling of N-terminal Arg/Lys units in post-translationally processed proteins with nonnatural amino acids, ChemBioChem., 7, 1676-1679 (2006).
• （30）M. Taki, Y. Tokuda, T. Ohtsuki, and M. Sisido, Nonnatural mutagenesis in insect cell-free translation system. Design of Carrier tRNAs and Selection of Four-Base Codons for Efficient Incorporation of Various Nonnatural Amino Acids into Proteins in Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) Insect Cell-Free Translation System, J. Biosci. Bioeng., 102(6), 511-517 (2006).
• （31）D. Kajihara, R. Abe, I. Iijima, C. Komiyama, M. Sisido, and T. Hohsaka, FRET analysis of protein conformational change through position-specific incorporation of fluorescent amino acids. Nature Methods, 3, 923-929 (2006).
• （32）宍戸昌彦、瀧真清、大槻高史、芳坂貴弘、“非天然アミノ酸の導入による蛋白質の蛍光ラベル法とその応用”、蛋白質核酸酵素51 (5), 399-407 (2006).
• （33）宍戸昌彦、“4塩基コドンの発見と非天然アミノ酸の蛋白質への導入”、化学と工業、59(12), 1255-1257 (2006).
• （34）M. Taki and M. Sisido, Leucyl/Phenylalanyl(L/F)-tRNA-Protein Transferase-Mediated Aminoacyl Transfer of a Nonnatural Amino Acid to the N-Terminus of Peptides and Proteins and Subsequent Functionalization by Bioorthogonal Reactions, Biopolymers, Peptide Science, 88, 263-271 (2007).
• （35）A. Fujii, A. Fujii, H. Shinohara, H. Kato, and M. Sisido, Detection of Direct Electron Transfer between a Redox Enzyme and an Extended Gold-Gate Using a Chemical CCD, Electrochemistry, 75(4), 342-344 (2007).
• （36）Y. Doi, T. Ohtsuki, Y. Shimizu, T. Ueda, and M. Sisido, EF-Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system, J. Am. Chem. Soc., in press.
• （37）M. Taki, H. Kuroiwa, and M. Sisido, Chemoenzymatic transfer of fluorescent nonnatural amino acids to the N-terminus of a protein/peptide, ChemBioChem, in press.
• （38）M. Sisido, “Synthetic Expansion of the Central Dogma”, in “Chemical Biology”, Chapter 5.2, ed. by S. Schreiber, T. Kapoor, G. Wess, Chapter 5.1, pp. 271-295, WILEY-VCH, Weinheim (2007).
• （39）M. Sisido, “Synthetic peptides and engineered proteins containing nonnatural amino acids as function centers”, in “BOTTOM-UP NANOFABRICATION: Supramolecules, Self-Assemblies, and Organized Films”, Ed. By K. Ariga (2007)
• （40）瀧真清、宍戸昌彦、“タンパク質工学の基礎”、“バイオプロセスハンドブック”、エヌ・ティー・エス、27-58 (2007).

国際会議招待講演

• （1）M. Sisido, tRNA-Selective aminoacylation with nonnatural amino acids -- A key step towards synthetic microorganism --The 3rd Peptide Engineering Meeting 7/17-18, 2003, Boston, USA
• （2）M. Sisido, Synthetic Expansion of the Central Dogma---Peptide Nucleic Acids, Chemical Aminoacylation, 4-Base codons, and Nonnatural Mutagenesis, The 18th American Peptide Symposium, July 20-23, 2003, Boston, USA
• （3）M. Sisido, Point-to-Point Electron Transfer and Energy Transfer on a Protein--- A new tool for the analysis of 3-dimensional structure of a protein---, The 4th Chitose International Forum (CIF4) on Photonics Science & Technology, December 3-4, 2003, Chitose, Japan
• （4）M. Sisido, Synthetic Expansion of the Central Dogma-Chemical Aminoacylation and 4-Base Codon/Anticodon Pairs--, Mini-Symposium on Current Topics in Chemical Biology, , May 8, 2004, Copenhagen, Denmark
• （5）M. Sisido and T. Hohsaka, Expansion of the Central Dogma and its Application to Position-Specific Fluorescence Labeling of Proteins, 4^th European-Japanese Bioorganic-Conference, Chemical Biology COE Program Sponsored by Okayama University, March 16, 2005, Ushimado, Okayama, Japan (Invited Lecture).
• （6）M. Sisido, Synthetic Expansion of the central dogma to include nonnatural amino acids, Designed Protein Alterations and Their Applications, Pacifichem2005, Dec. 19, 2005, Hawaii, USA
• （7）M. Sisido, Incorporation of Fluorescent Amino Acids into Proteins through PNA-mediated Aminoacylation of tRNA, 8th Peptide Forum: “Innovative Methodology of Peptide-Protein Synthesis and Future Perspective of Chemical Biology”, Kyoto Pharmaceutical University, July 1, 2006
• （8）M. Sisido, M. Nishimura, T. Minohata, K. Ninomiya, M. KItamatsu, tRNA Aminoacylation Using Peptide Nucleic Acid as a Carrier of Amino Acid Esters, the 9th Chinese International Peptide Symposium, July. 5, 2006, International Convention Center, Shanghai, China
• （9）M. Sisido, Synthetic expansion of the central dogma to include nonnatural amino acids, The 11th Akabori conference, Sept. 11-13, 2006, Cloister of Banz, Germany

（1）多種類の蛍光性非天然アミノ酸を用いた高効率薬剤探索法

　蛍光基を側鎖にもつ非天然アミノ酸は種々の生化学研究に有用であり、その一部は市販されるに至っている。また蛍光性アミノ酸をtRNA（運搬リボ核酸）に結合したものも市販されるようになり、非天然アミノ酸を蛋白質に導入する手法が汎用生化学研究ツールとして使用できるようになった。これらを背景として、多種類の蛍光性非天然アミノ酸導入ペプチドや蛋白質を薬剤探索や医療診断へ応用する研究がすすんでいる。とくに、20種類程度の多種類の蛍光性非天然アミノ酸を蛋白質やペプチドに導入し、多成分蛍光標識蛋白質ライブラリーやペプチドライブラリーを作製する手法は、新規薬剤探索法として期待される。従来のペプチド系薬剤探索は、ペプチドをファージ、ビーズ、あるいはRNA（リボ核酸）に結合したままでスクリーニングしていた。そのため選択されてきたペプチドをそれらから切り離すと活性を失う場合が多かった。多成分蛍光標識法では、蛍光標識ペプチドをそのままの形で溶液中で競争的にスクリーニングするため、見出されたペプチド類は生体中でも機能する確率が高く、有効な薬剤発見につながることが大いに期待される。この手法には蛍光性非天然アミノ酸のペプチドや蛋白質への導入が不可欠であり、特別推進研究で発展させた手法の応用として、もっとも期待されるものである。

（2）リボソームを用いないで、非天然アミノ酸をペプチドのN末端に導入する新手法

　tRNA（運搬リボ核酸）に結合したアミノ酸を、リボソームを用いずにペプチドや蛋白質のN末端に導入する酵素的手法が見いだされた。この方法は微量のアミノ酸を簡単、迅速にペプチドや蛋白質に導入することができることから、生体イメージングに広く応用できるものである。とくに¹⁸Fをもつ非天然アミノ酸を導入することが可能であり、現在実際のPET（ポジトロン断層法）研究に進む準備をしている。

研究手法の活用状況

　非天然アミノ酸の蛋白質導入技術は、特別推進研究発足当時は世界で数人の研究者が行っている特殊な手法であった。現在この方法はかなり一般化され、世界で数十人の研究者が利用するようになってきたが、なお一般的方法とは言い難い。その大きな理由はこの方法に有機化学的なステップが含まれており、それらを生化学者が嫌うことにあるとおもわれる。この方法を生化学の一般的なツールにするために、蛍光性アミノ酸を担持したtRNA（運搬リボ核酸）が数年前から市販されるようになった。これによって本手法が広く利用されるようになることを期待している。
　また他の問題として、この方法を使わなければどうしてもできない重要研究分野がいままであまりなかったことがある。たとえば蛋白質の蛍光標識については、現在ではGFP（緑色蛍光タンパク質）に代表される蛍光性蛋白質と標的蛋白質とのキメラ蛋白質作製が主な手法となっている。この方法にはGFP（緑色蛍光タンパク質）が大きすぎるという大きな欠点があるにも関わらず、生化学者はほとんどがこの方法を採用している。蛍光性非天然アミノ酸導入法でなければどうしてもできない重要な手法として、前記の多成分蛍光標識ライブラリーによる薬剤探索、および¹⁸F含有非天然アミノ酸導入ペプチドによるイメージングがある。現在これらの応用に向けた研究を進めている。

試料の市販状況

　本手法を広く普及させるためには、非天然アミノ酸やそれらをtRNA（運搬リボ核酸）に結合したものなどの市販が望まれる。蛍光性非天然アミノ酸については、すでに薬品業者から数点が発売されている。また上述のように蛍光性非天然アミノ酸をtRNA（運搬リボ核酸）に結合させたものも市販されるようになった。

他研究者との共同研究状況

　特別推進研究期間終了後に、いくつかの研究者から共同研究の打診があった。たとえばデンマーク薬科大学からは大学院学生が派遣されて6ヶ月当研究室に滞在し、この方法を習得させた。現在はデンマークで研究が続けられ、2007年中に博士論文が提出される予定である。このほかにも試料提供などで協力したものが数件ある。

化学生物学分野の勃興

　より広い意味の学界への貢献として、有機化学手法を生化学系に持ち込めることを証明した例になったことが挙げられる。このような分野は本特別推進研究期間の前後から欧米ではChemical Biologyという名前で呼ばれており、欧米の主要大学の化学系の学科名がDepartment of Chemistry and Chemical Biologyと改称されるなどの例が増えている。ただし残念ながらわが国ではこの分野への取り組みが大きく遅れている。たとえばHarvard大学の化学生物学科のヘッドであるSchreiber教授らが本年編纂した単行本"Chemical Biology"の著者の内、日本の大学の著者はまだ宍戸だけである。

研究期間中に発表された論文

• T. Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Sasaki, H. Murakami, and M. Sisido, Incorporation of Two Different Nonnatural Amino Acids Independently into a Single Protein through Extension of the Genetic Code, J. Am. Chem. Soc., 121(51), 12194-12195 (1999).　「4塩基コドンを用いて2種類の非天然アミノ酸を一本の蛋白質に導入」83件
• T. Hohsaka and M. Sisido, Incorporation of non-natural amino acids into proteins, Curr. Opinion Chem. Biol. 6, 809-815 (2002).　「非天然アミノ酸の蛋白質への導入（総説）」55件
• T. Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Taira, H. Murakami, and M. Sisido, Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Proteins by Using Various Four-Base Codons in an E. coli in vitro Translation System, Biochemistry, 40(37), 11060-11064 (2001).　「大腸菌生合成系を用い種々の4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸導入」54件
• M. Sisido, S. Hoshino, H. Kusano, M. Kuragaki, M. Makino, H. Sasaki, T.A. Smith, and K. P. Ghiggino, Distance Dependence of Photoinduced Electron Transfer along alfa-Helical Polypeptides, J. Phys. Chem. B, 105(42), 10407-10415 (2001).　「αへリックスポリペプチド上での光誘起電子移動の距離依存性」30件
• H. Murakami, T. Hohsaka, and M. Sisido, Random Insertion and Deletion of Arbitrary Number of Bases for Codon-Based Random Mutation of DNAs, Nature Biotech., 20(1), 76 - 81 (2002).　「コドン単位でのランダム変異DNA作製のための任意数の塩基のランダムな挿入と除去」29件
• T. Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Murakami, and M. Sisido, Five-Base Codons for Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Proteins, Nucleic Acids Res., 29(17), 3646-3651 (2001).　「5塩基コドンを用いた非天然アミノ酸の蛋白質への導入」26件
• M. Taki, T. Hohsaka, H. Murakami, K. Taira, and M. Sisido, Position-Specific Incorporation of a Fluorophore-Quencher Pair into a Single Streptavidin through Orthogonal Four-Base Codon/Anticodon Pairs, J. Am. Chem. Soc., 124(49), 14586-14589 (2002).　「直交4塩基コドン/アンチコドンの組み合わせによる蛍光基－消光基対の一本のストレプトアビジンへの導入」25件
• M. Taki, T. Hohsaka, H. Murakami, K. Taira, and M. Sisido, A non-natural amino acid for efficient incorporation into proteins as a sensitive fluorescent probe, FEBS Lett., 507(1), 35-38 (2001).　「高感度蛍光プローブとしての非天然アミノ酸の高効率導入」24件
• H. Murakami, T. Hohsaka, Y. Ashizuka, K. Hashimoto, and M. Sisido, Site-Directed Incorporation of Fluorescent Nonnatural Amino Acids into Streptavidin for Highly Sensitive Detection of Biotin, Biomacromolecules, 1(1), 118-125 (2000).　「ストレプトアビジンに蛍光性非天然アミノ酸を導入し、ビオチンを高感度で検出」19件
• N. Muranaka, T. Hohsaka, and M. Sisido, Photoswitching of Peroxidase Activity by Position-Specific Incorporation of a Photoisomerizable Nonnatural Amino Acid into Horseradish Peroxidase, FEBS Lett., 510, 10-12 (2002).　「光異性化する非天然アミノ酸の西洋わさびペルオキシダーゼへの導入とペルオキシダーゼの活性のスイッチング」19件

研究期間終了後に発表された論文

• T. Hohsaka, N. Muranaka, C. Komiyama, K. Matsui, S. Takaura, R. Abe, H. Murakami, and M. Sisido, Position-Specific Incorporation of Dansylated Nonnatural Amino Acids into Streptavidin by using a four-base codon, FEBS Lett., 560, 173-177 (2004)　「4塩基コドンによって蛍光性アミノ酸をストレプトアビジンに導入」11件
• K. Ninomiya, T. Minohata, M. Nishimura and M. Sisido. In Situ Chemical Aminoacylation with Amino Acid Thioesters Linked to a Peptide Nucleic Acid, J. Am. Chem. Soc., 126, 15984-15989 (2004).　「ペプチド核酸を用いて特定のtRNA（運搬リボ核酸）をアミノアシル化した」8件
• M. Kitamatsu, M. Shigeyasu, T. Okada, and M. Sisido, Oxy-peptide nucleic acid with a pyrrolidine ring that is configurationally optimized for hybridization with DNA, Chem. Comm. 2004(10), 1208-1209 (2004).　「DNAに結合するように最適化された構造をもつピロリヂン環を含むペプチド核酸」7件
• T. Ohtsuki, T. Manabe and M. Sisido, Incorporation of multiple kinds of nonnatural amino acids into a protein by tRNAs with nonstandard structures, FEBS Lett., 579, 6769-6774 (2005).　「異常構造をもつtRNA（運搬リボ核酸）を用いた蛋白質への複数の非天然アミノ酸の導入」6件
• H. Hamada, N. Kameshima, A. Szymańska, K. Wegner, L. Łankiewicz, H. Shinohara, M. Taki and M. Sisido, Position-Specific Incorporation of a Highly Photodurable and Blue-Laser Excitable Fluorescent Amino Acid into Proteins for Fluorescence Sensing, Bioorg. Med. Chem. 13(10), 3379-3384 (2005)　「青色レーザーで励起される安定な蛍光性アミノ酸の蛋白質への導入と蛍光センシング」5件
• D. Kajihara, T. Hohsaka and M. Sisido, Synthesis and Improvement of Nonnatural Mutants of GFP Containing Aromatic Nonnatural Amino Acids at Tyr66 Position, Protein Eng. Design and Selection, 18(6), 273-278 (2005).　「非天然アミノ酸を66位に導入した緑色蛍光蛋白質の合成と、その蛍光特性の改善」5件
• N. Muranaka, T. Hohsaka and M. Sisido, Four-base codon mediated mRNA display to construct peptide libraries that contain multiple nonnatural amino acids, Nucleic Acids Res., 34(1), e7 (1-9) (2006).　「4塩基コドンを用いた複数の非天然アミノ酸を含むペプチドライブラリーの作製」5件
• H. Taira, M. Fukushima, T. Hohsaka, and M. Sisido, Four-Base Codon-Mediated Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Proteins in a Eukaryotic Cell-Free Translation System, J. Biosci. Bioeng. 99(5), 473-476 (2005).　「真核細胞無細胞翻訳系を用いた4塩基コドンを介した非天然アミノ酸の導入」3件
• M. Sisido, K. Ninomiya, T. Ohtsuki, and T. Hohsaka, Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with nonnatural amino acids, METHODS, 36(3):270-278 (2005).　「4塩基コドン/アンチコドンと非酵素的アミノアシル化による非天然アミノ酸の蛋白質導入」3件
• H. Nakata, T. Ohtsuki, R. Abe, T. Hohsaka and M. Sisido, Binding efficiencies of EF-Tu to tRNAs charged with fluorescent nonnatural amino acids, Anal. Biochem., 348(2), 321-323 (2006).　「蛍光性非天然アミノ酸を担持したtRNA（運搬リボ核酸）とEF-Tu（蛋白質伸張因子）との結合」3件
• M. Taki, J. Matsushita and M. Sisido, Expanding the Genetic Codes in a Mammalian Cell with Introduction of 4-Base Codon/Anticodon Pairs, ChemBioChem, 7, 425-428 (2006).　「哺乳類細胞中での4塩基コドン/アンチコドン導入による遺伝暗号の拡張」3件
• D. Kajihara, R. Abe, I. Iijima, C. Komiyama, M. Sisido, and T. Hohsaka, FRET analysis of protein conformational change through position-specific incorporation of fluorescent amino acids. Nature Methods, 3, 923-929 (2006).　「位置特異的蛍光性アミノ酸導入による蛋白質のFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）解析」3件

蛍光性アミノ酸の市販

　特別推進研究期間、あるいはその後当研究室が開発したいくつかの蛍光性非天然アミノ酸の内2種類が市販され、生化学、ペプチド化学の研究者に利用されている。

蛍光性アミノ酸導入キットの市販

　本特別推進研究の分担者であった、芳坂助手（現在北陸先端科学技術大学院大学　准教授）は蛍光性アミノ酸を担持したtRNA（運搬リボ核酸）を含む、蛍光性アミノ酸蛋白質導入キットを市販した。これにより生化学者が有機化学的手法にわずらわされることなしに、蛍光基を導入できるようになった。

蛍光性アミノ酸導入ペプチドや蛋白質の薬剤探索への応用

　蛍光性アミノ酸導入技術をペプチドライブラリーさらには蛋白質ライブラリーに応用する研究が始められている。従来の化学的蛍光修飾法では蛍光基が蛋白質の不特定の位置に導入されたり、蛍光基自体が細胞との結合に関与したりすることが多かった。本特定研究で開発された方法を用い、蛍光基を特定の位置に導入することにより、このような欠点を最小限に抑えた蛍光標識が可能である。
  種類程度の多様性をもつペプチドライブラリーを作製し、それを20種類程度のサブライブラリーに分割する。サブライブラリーごとに異なる種類の蛍光性アミノ酸を導入しておく。このサブライブラリー混合物を標的細胞や標的蛋白質と混合し、それらと結合するサブライブラリーを選択する。後者の蛍光スペクトルの解析から、どのサブライブラリーがもっとも強く細胞や蛋白質に結合していたかを知ることができる。この操作を繰りかえすことにより、細胞や蛋白質に強く結合する薬剤候補化合物を見出すことができる。
　この方法での新規薬剤探索研究が、現在岡山大学に採択されている科学技術振興調整費「ナノバイオ標的医療の融合的創出拠点の形成」（代表者　岡山大学医歯薬学研究科教授　公文裕巳）の下で進められている。

リボソームを用いない簡単、迅速な非天然アミノ酸のペプチド導入

　ペプチドのN末端に非天然アミノ酸1個を簡単迅速に導入できる手法が開発された。これを用いて、生体イメージング用のプローブ分子の開発が、上と同じプロジェクトの一環として進められている。

本特別推進研究の期間分担研究者であった研究者の現在の所属

篠原寛明（岡山大学工学部助教授）

• 平成15年4月　富山大学工学部教授

芳坂貴弘（岡山大学工学部助手）

• 平成15年4月　北陸先端科学技術大学院大学助教授（現在准教授）

その他の若手研究者（特別推進研究期間当時のポジションとその後の状況）

瀧真清（学術振興会博士研究員）

• 平成13年4月　産業総合研究所博士研究員
• 平成15年8月　岡山大学工学部助手（現在助教）

北松瑞生（岡山大学技術職員）

• 平成17年9月　岡山大学で博士号取得
• 平成18年9月　岡山大学工学部助手（現在助教）

桑原正靖（博士後期課程学生）

• 平成13年4月　米国バージニア州立大学博士研究員
• 平成14年6月　群馬大学工学部助手（現在助教）

村上裕（博士後期課程学生）

• 平成14年4月　米国ニューヨーク州立大学バッファロー校博士研究員
• 平成15年4月　東京大学先端科学技術研究センター助手（現在助教）

二宮啓子（学内資金による博士研究員）

• 平成16年4月　みどり特許事務所
• 平成18年4月　京都大学工学部技術職員

　本特別推進研究に関係した研究者全員が、研究を遂行できるポジションを得て各地で活躍している。